Isabella von Portugal wurde am 24. Oktober 1503 in Lissabon, Portugal, geboren. Sie war die Tochter von König Manuel I. von Portugal und dessen erster Ehefrau Maria von Aragón. Isabella hatte sechs Geschwister, darunter den späteren König Johann III.
Im Alter von 10 Jahren wurde Isabella mit dem spanischen Kronprinzen Karl (später bekannt als Kaiser Karl V.) verlobt, um die politischen Beziehungen zwischen Portugal und Spanien zu stärken. Die beiden heirateten schließlich im Jahr 1526, als Isabella 22 Jahre alt war.
Während ihrer Ehe hatte Isabella von Portugal sechs Kinder, darunter den späteren König Philipp II. von Spanien. Obwohl die Ehe politisch arrangiert war, gab es Berichte über eine glückliche Beziehung zwischen Isabella und Karl.
Isabella von Portugal war bekannt für ihre Schönheit und ihre musikalischen Talente. Sie spielte das Spinett und komponierte eigene Musikstücke. Sie war auch eine Förderin der Künste und unterstützte Künstler und Musiker am spanischen Hof.
Isabella starb am 1. Mai 1539 im Alter von 35 Jahren in Toledo, Spanien. Ihr Tod wurde als tragisch angesehen, da sie als vielversprechende Ehefrau und Mutter angesehen wurde und ihr früher Tod den spanischen Hof in Trauer versetzte.
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